化膿隱秘桿菌是家養(yǎng)動物和野生動物化膿性感染常見病原菌，感染此病原菌易造成組織器官膿腫,、化膿性炎癥,、纖維化、壞死及流產(chǎn),、死胎等疾病,，近年來，其在豬,、牛,、羊等動物上的發(fā)病率逐漸增加，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大經(jīng)濟(jì)損失,。目前尚無針對化膿隱秘桿菌病有效的防控措施，市場上也沒有商品化疫苗,，因此疫苗的研發(fā)應(yīng)用是防治化膿隱秘桿菌感染的重要方向之一,。
為向研發(fā)預(yù)防羊化膿性肺炎有效疫苗提供候選菌株，項(xiàng)目組從重慶,、四川,、內(nèi)蒙等地發(fā)病羊場病死羊的心臟、肺臟,、心包液等組織中分離鑒定化膿隱秘桿菌17株,，并對分離株開展了優(yōu)化培養(yǎng),、分子鑒定、生化鑒定,、藥物敏感性測定,、毒力因子檢測、生長曲線的測定,、小鼠毒力試驗(yàn),、菌株穩(wěn)定性等技術(shù)研究。
項(xiàng)目組針對菌株DNA進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增,，經(jīng)同源性分析并結(jié)合培養(yǎng)特性,，確定17株菌均為化膿隱秘桿菌；研究確定使用TSA培養(yǎng)基添加8%小牛血清為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)化膿隱秘桿菌的適宜培養(yǎng)基,，通過套袋培養(yǎng)解決了其難培養(yǎng),、生長速度慢的問題；17株化膿隱秘桿菌分離株形態(tài)大小正常且均為純培養(yǎng)物,，生長曲線相似,；藥物敏感性試驗(yàn)表明17株菌對同種藥物的敏感性存在一定區(qū)別，但都對復(fù)方新諾明,、多粘菌素B,、頭孢呋辛的敏感性較高，對紅霉素,、羧芐西林的敏感性不高,，對慶大霉素、卡那霉素等氨基糖甙類抗生素幾乎不敏感,。通過小鼠致病性結(jié)果顯示,，4、10,、13號菌株毒力最強(qiáng),，小鼠腹腔注射2×108個菌，感染后36～72h出現(xiàn)集中死亡,，臨床表現(xiàn)為被毛粗亂,，雙眼微閉，解剖肺臟出血性病變明顯,，腹腔腸道有液化現(xiàn)象,，肝臟表面有黏膿性物質(zhì)附著；對化膿隱秘桿菌11種毒力因子進(jìn)行PCR檢測,，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間攜帶的毒力基因種類存在差異,，但17株分離株均攜帶菌毛蛋白E(fimE)、溶血素(plo)基因,、依賴atp的Clp蛋白酶,、絲氨酸蛋白酶,，同時3株強(qiáng)毒力菌株均具有神經(jīng)氨酸酶（NanP、NanH）,。后期擬針對4,、10、13號菌株開展免疫效果分析,，以期能篩選出毒力強(qiáng),、穩(wěn)定性好、免疫原性佳的的菌株作為羊化膿隱秘桿菌滅活疫苗的候選株,。
圖1化膿隱秘桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)
圖2感染小鼠肝臟黏膿性物質(zhì)附著
圖3感染小鼠肺臟出血性病變
圖4 17株化膿隱秘桿菌plo基因檢測
1為陰性對照,；2～20為化膿隱秘桿菌分離株；M為marker